发布单位 | 农业部 农业部 | 发布文号 | 农业部公告第2078号 |
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发布日期 | 2014-03-12 | 生效日期 | 暂无 |
有效性状态 | 废止日期 | 暂无 | |
备注 |
根据《兽药管理条例》和《兽药注册办法》规定,我部组织制定了口蹄疫灭活疫苗内毒素和总蛋白测定法,现予发布,自发布之日起执行。
特此公告。
附件:1.口蹄疫灭活疫苗内毒素测定法
2.口蹄疫灭活疫苗总蛋白测定法
农业部
2014年3月12日
附件1
口蹄疫灭活疫苗内毒素测定法
吸取12 ml疫苗放入15 ml离心管中,置50±5℃水浴90分钟,然后在4℃条件下,以15000 g离心10分钟,取水相5.0 ml,按现行《中国兽药典》一部附录进行检验。每头份疫苗中内毒素含量应不高于50 EU。
附件2
口蹄疫灭活疫苗总蛋白测定法
取1瓶疫苗恢复至室温,在3个1.5ml离心管中分别精确加入100μl疫苗和900μl丙酮,充分混匀,室温放置10分钟,在4℃条件下,以15000g离心15分钟。吸弃液相,沉淀物用400μl丙酮洗涤2次,室温干燥约15分钟,加50μl去离子水复溶后,按附注进行检验。每毫升疫苗总蛋白含量应不高于500μg。
附注:口蹄疫灭活疫苗总蛋白测定法
1.方法与原理
本法适用于口蹄疫病毒油佐剂灭活疫苗总蛋白含量检测。本法系福林酚法(lowry法),依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cμ2+螯合形成蛋白质-铜复合物,此复合物使酚试剂的磷钼酸还原,产生蓝色化合物,同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比,以蛋白质对照品溶液作标准曲线,采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。
2.试剂与仪器
2.1试剂丙酮(分析纯)、无菌去离子水、商品化Lowry法改良试剂盒;
2.2设备酶标仪(全波长),“Μ”型96孔板,卡介苗注射器,单通道和多通道移液器,涡旋震荡仪,酶标板振荡器等。
3.操作步骤
3.1标准系列稀释液制备将商品化试剂盒内标准牛血清白蛋白(2mg/ml母液),按下表依次稀释。
编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
母液(μl) | 0 | 5 | 25 | 50 | 100 | 150 | 200 | 300 | 400 |
去离子水(μl) | 400 | 395 | 375 | 350 | 300 | 250 | 200 | 100 | 0 |
终浓度(μg/ml) | 0 | 25 | 125 | 250 | 500 | 750 | 1000 | 1500 | 2000 |
3.2检验疫苗处理取1瓶疫苗恢复至室温摇匀后,在3个1.5 ml离心管中分别精确加入100μl疫苗和900μl丙酮,充分混匀,室温放置10分钟,在4℃条件下,以15000 g离心15分钟。吸弃液相,沉淀物用400μl丙酮洗涤2次,室温干燥约15分钟,加50μl去离子水复溶备用。
3.3反应板加样与读数
3.3.1各取3.1稀释的各浓度牛血清白蛋白标准溶液40μl,以及三重复待检疫苗样品40μl,分别加入到96孔板内。用排枪迅速加入200μl改良lowry法试剂盒内试剂,立即用振荡器混匀30秒;
3.3.2封膜,室温孵育10分钟;
3.3.3各孔内分别加入20μl 1倍酚试剂(试剂盒内为2倍,用前用去离子水现稀释),立即用振荡器混匀30秒;
3.3.4封膜,室温孵育30分钟;
3.3.5酶标仪测定750nm吸光值,保存读数。
3.4数据处理
根据系列标准蛋白稀释液的浓度(0μg/ml~2000μg/ml)和750nm吸光值,使用EXCEL以吸光值为X轴,以蛋白标准浓度为Y轴,绘制标准曲线,依据趋势线求得多项式,其多项式R2≥0.98。
将被检样品的吸光值代入标准蛋白获得的多项式,计算样品中蛋白含量,根据取样量求得1ml样品中蛋白含量。例如口蹄疫灭活疫苗水相/油相比例为1:1,免疫剂量为2ml时,100μl疫苗经丙酮沉淀后用50μl去离子水复溶,测得浓度即为每头份疫苗中蛋白浓度,或2ml疫苗中蛋白浓度。结果判定时,将测定值除以2即得每毫升疫苗中总蛋白含量。
3.5结果判定
若测定结果为每毫升疫苗总蛋白含量小于或等于500μg,则判定被检疫苗总蛋白含量符合规定;若测定结果为每毫升疫苗总蛋白含量大于500μg,判定被检疫苗总蛋白含量不符合规定。
3.6检测数据处理举例
3.6.1收集数据如表所示
Value | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
A | 0.102 | 0.149 | 0.336 | 0.504 | 0.836 | 1.122 | 1.334 | 1.702 | 1.923 | -- | -- | -- |
B | 0.677 | 1.722 | 0.252 | 1.116 | 2.167 | 1.020 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
C | 0.640 | 1.704 | 0.230 | 1.050 | 2.195 | 0.962 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
D | 0.641 | 1.716 | 0.225 | 1.061 | 2.175 | 1.012 | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
E | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
F | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
G | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
H | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- | -- |
上述表格中,A1-A9为系列稀释的标准牛血清白蛋白溶液,A1至A9蛋白浓度依次增高;B、C、D行中1-6列为检测样品750nm吸光值,B1-B6为6批不同批次疫苗样品,每一列为同一疫苗样品三个重复。
3.6.2绘制标准曲线:将上表中数据复制到EXCELL表格中,
Value | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
OD750 | 0.102 | 0.149 | 0.336 | 0.504 | 0.836 | 1.122 | 1.334 | 1.702 | 1.923 |
蛋白浓度μg/ml | 0 | 25 | 125 | 250 | 500 | 750 | 1000 | 1500 | 2000 |
采用EXCEL程序,选中1-9列对应的两行数据→“插入”→“散点图”,选择“带平滑线和数据标记的散点图”,得到以750nm吸光值为X轴,以蛋白浓度为Y轴的曲线图。选择“图表工具”中“布局”→ “趋势线”→“其他趋势线选项”,选中“多项式”、“显示公式”和“显示R平方值”。通常R平方值大于等于0.98表明标准曲线可信。每一块96孔板应设一组标准并绘制相应标准曲线。
3.6.3数值计算
以样品测定OD750值为X,代入y = 411.69x2+ 220.65x - 3.9423,Y为蛋白浓度,以表中第一批疫苗测定结果为例。该疫苗三重复测定的OD750数据(X)分别为:0.677、0.640、0.641,代入公式计算蛋白含量(Y)分别为:334μg/ml、306μg/ml、307μg/ml,该数据为每毫升水相抗原中总蛋白含量。计算三重复数值的平均值(AVERAGE)为316μg/ml,标准差(STDEV.P)为13.1,变异系数为4.15%(标准差/平均值*100%),将每毫升水相抗原中总蛋白含量,除以2折算为每毫升疫苗总蛋白含量,该疫苗的总蛋白含量为138μg/ml。按照上述方法,可计算其他样品的总蛋白含量。
3.6.4结果判定
同一样品不同重复间变异系数应小于5.3%,否则试验不成立,应重做。若测定值小于或等于500μg/ml,则判定被检疫苗总蛋白含量符合规定;若测定值大于500μg/ml,则判定被检疫苗总蛋白含量不符合规定。