转基因植物及其产品检测 通用要求

前 言

本标准由中华人民共和国农业部科技教育司提出。

本标准起草单位：中国农业科学院植物保护研究所、中国农业科学院生物技术所、农业部科技发展中心、中国农业大学。

本标准主要起草人：彭于发、王锡锋、李宁、张大兵、罗云波、黄昆仑、汪其怀、贾士荣。

本标准为首次发布。

转基因植物及其产品检测 通用要求

1范围

本标准规定了转基因植物及其产品检测的通用要求及转基因植物PCR检测实验室的操作规范。

本标准适用于转基因植物及其产品中转基因成分的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适合于本标准。

GB/T15481-2000 检测和检验实验室能力的通用要求

GB/T6682 分析实验用水规格和试验方法

NY/T673 转基因植物及其产品检测 抽样

NY/T674 转基因植物及其产品检测 DNA提取和纯化

NY/T675 转基因植物及其产品检测 大豆PCR方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1 一般术语 General terms

3.1.1 转基因生物 genetically modified organism (GMO)

通过基因工程技术改变基因组构成的生物。包括转基因植物、动物和微生物。

3.1.2 转基因植物 genetically modified plant organism (GMP), transgenic plant

通过基因工程技术改变基因组构成的植物，是转基因生物的一类。

3.1.3 定性检测极限 detection limit

以转基因生物（如种子）提取的DNA或标准双链DNA分子作为PCR反应的模板，所能检测到的脱氧核糖核酸（DNA）的极限（需要确保阳性样品的纯度，才能达到本标准检测方法的灵敏度）。

3.2 与DNA提取和纯化相关的术语 Terms relative to extraction and purification of DNA

3.2.1 DNA提取 DNA extraction

将DNA从一个样品的多种组分中分离出来。

3.2.2 DNA纯化 DNA purification

获得不含PCR反应抑制因子的DNA。

3.3 与DNA扩增和PCR技术相关的术语 Terms relative to DNA amplification and to the PCR technique

3.3.1 DNA扩增 DNA amplification

体外放大DNA分子拷贝数的生物学方法，如PCR。

3.3.2 扩增子 amplicon

由PCR等DNA扩增方法产生的DNA片段。

3.3.3 聚合酶链式反应（PCR）polymerase chain reaction，

模板DNA经高温变性为单链，在DNA聚合酶和适宜温度下，两条引物分别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火，并在DNA聚合酶的催化下以四种dNTP （deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸）为底物，使退火引物延伸从而合成DNA，如此变性、退火和合成DNA反复循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。

3.3.4 引物 primer

一定长度和顺序的寡核苷酸链。

3.3.5 筛查检测法 detection by screening

用多种转基因植物共有的标记基因、表达调控序列等通用元件对被检产品中是否含有转基因成分进行PCR检测的方法。

3.3.6 身份检测法 detection by identification

与标准品比较确定GMO身份的检测方法。

3.3.7 靶序列(目的DNA) target sequence (target DNA)

PCR反应中检测特异性扩增的DNA序列。

3.3.8 旁邻片段 (边界序列) border fragment (border region, border sequence)

插入在染色体上的外源基因序列和宿主生物基因组片段连接的DNA片段。

3.3.9 终点法分析 endpoint analysis

一种定性、定量的分析方法，如ELISA-PCR，可对PCR反应的扩增子进行定性和定量分析。

3.3.10 实时分析 real-time analysis

一种贯串PCR反应过程，对PCR扩增效率、扩增情况及数据进行监控的定量PCR分析方法，如荧光探针的杂交过程的监控。

3.3.11 连接片段 junction fragment

两个不同功能基因序列之间的连接序列或片段。

3.4 与对照相关的术语 Terms relative to controls

3.4.1 GMO阳性对照 GMO positive control

用于PCR扩增的标准目的DNA或转基因植物源材料的DNA分子。

3.4.2 GMO阴性对照 GMO negative control

用于PCR扩增的标准非转基因植物材料的DNA分子。

3.4.3 PCR内部对照 PCR internal control

加入一种无关的DNA序列到纯化DNA的样品中，然后再进行PCR扩增，以检测是否存在PCR反应的抑制物质。

3.4.4 阳性PCR对照 positive PCR control

用含有目的序列的样品DNA进行PCR扩增。

3.4.5 阴性PCR对照 negative PCR control

用不含有目的序列的样品DNA进行扩增。

3.4.6 PCR空白对照 PCR blank, negative reagent control

以水或不含目的DNA试剂进行PCR反应，以验证PCR反应过程中不被污染。

3.4.7 阴性假定对照 negative premise control

在样品检测整个操作过程中，敞开PCR反应体系，以证明检测的操作环境中不含有目的基因片段的污染。

3.4.8 阴性提取对照 negative extraction control

以水作为材料提取DNA，以证明DNA的抽提和制备过程中是否发生污染。

3.5 与探针相关的术语 Terms relative to probes

3.5.1 探针 probe

在引物之间的与目的片段特异性杂交的15—30bp寡核鼓苷酸链.

3.5.2 内部探针 internal probe

标记的内部探针。

3.5.3 内标准基因（内源参照基因） endogenous reference gene

具有植物物种专一性且拷贝数恒定、不显示等位基因变化的保守DNA序列。可用于对基因组中某一目的基因进行定量分析和验证PCR反应体系中是否存在抑制物质。

4原则

转基因生物及其产品的定性和定量PCR检测通常包括四个步骤：

――抽样

在一批物品中抽取具有代表性的材料，用于检测分析。

――样品DNA提取和纯化

样品DNA提取和纯化一般包括样品组织破碎、DNA释放和DNA从其他化合物中纯化等几个步骤。

――DNA扩增

对目的序列进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

――结果分析

对PCR产物进行定性或定量分析，确定试验样品是否含有转基因成分或确定转基因成分的含量。

5 实验室通用要求

5.1 一般要求

转基因植物及其产品检测实验室一般要求按GB/T15481执行。

5.2 特殊要求

转基因植物及其产品检测实验室分为三个区：

5.2.1 前PCR区

前PCR区专门用于准备各种PCR反应体系，此区域必须保持清洁干净，而且没有来自分子克隆和样品准备的污染源，前PCR区的试剂、设备和正压活塞式移液器必须是专用的。

5.2.2 样品准备区

样品准备区专门用于样品的制备，在制备和操作用于核酸提取的试剂时应采取以下预防措施：

a) PCR产物和带有要扩增的序列的DNA克隆不在该区域进行；

b) 检测的样品都带入样品准备间处理，根据需要提取DNA；

c) DNA样品用专门防护或正压活塞式移液器操作，防止在吸取样品时有气溶胶遗留；

d) 大体积样品用单独包装的无菌一次性移液管吸取。

任何时候都穿实验服和戴手套，手套要经常更换，尤其在提取DNA过程中每一步之间都要更换。实验服要专门用于样品准备间，经常清洗。

5.2.3 PCR区

PCR区专门用于PCR反应和反应后样品的处理，该区使用的所有试剂、一次性器材和仪器都是专用的。由于PCR实验室所遇到的主要污染源是前一次PCR过程的产物，因此前PCR区和PCR区之间试剂和人员不能混杂，实验室的交通方向是单向的，永远从“净区”到“脏区”。

6 试剂

6.1 通用要求

6.1.1 用水应符合GB6682中一级水的规格。

6.1.2 所有化学试剂如果没有特别说明，应没有DNA和核酸酶的污染，应不含PCR抑制剂。

6.1.3 所有试剂应按照shuomingshu要求进行保存。

6.2 DNA提取和纯化试剂

按NY/T674执行。

6.3 DNA扩增试剂

按NY/T675执行。

7 仪器和设备

通用设备按GB/T15481-2000执行

所有仪器设备应避免植物DNA和核酸酶的污染。

所有仪器设备，尤其取样器等与试验样品接触的器具，应清洁、不对样品造成污染。

盛装样品的容器或包装袋应为一次性使用的，以避免交叉污染。

8 操作程序

8.1 通用要求

应设可以检测或分析下列情况的对照：

――假阳性；

――假阴性；

――存在干扰分析的物质；

――分析物质降解；

――降低检测方法的灵敏度；

――降低分析物质回收率。

8.2 抽样

按照NY/T673的方法抽样。

抽取的样品应具有代表性。

取样过程中应避免样品散落，防止转基因植物及其产品扩散。

8.3 实验室样品和试验样品的准备与储存

样品的制备方法视样品的状态和特性而定。固态样品的制备宜先粉碎至满足DNA提取的技术要求，或用液氮研磨至DNA充分释放并满足DNA抽提的技术要求。液态样品的制备宜用缓冲液或水充分洗涤，直至其中的DNA完全溶于缓冲液或水中为止。

在接收时应注明并记录样品重量、生产和包装条件。

样品在测试前后应放置在密闭的容器内，防止交互污染。

样品应在保持组分不发生变化的条件下储存。

易腐烂的样品在分析前应根据需要在4℃、-20℃或-80℃储存，如有特殊需要应在无氧条件下储存。

应记载储藏条件和时间。

存查样品应妥善保存3个月。检测为GMO的样品应妥善保存6个月，以备复验。保存期满后，需经无害化处理。

8.4 DNA提取和纯化

DNA提取和纯化按照NY/T674的方法。

8.5 定性PCR检测

定性PCR检测按照我国或国际认可的方法。

定性PCR检测对象包括转基因的目的基因、启动子、终止子、标记基因等外源基因和元件。检测时应设阳性对照、阴性对照、试剂空白对照和提取空白对照，同时应检测内源基因。

8.6 以蛋白质为基础的检测

以蛋白质为基础的检测按照我国或国际认可的方法。

9 通用质量保证措施

检测物品的处置按GB/T15481执行。

检测结果质量的保证按GB/T15481-2000中的5.9执行。

10 结果分析与表述

10.1 通用要求

检测结果不宜表述为分析样品不含转基因生物。

10.2 结果分析

10.2.1 通用要求

以下情况认为样品含有转基因植物DNA：

――扩增片段的特异性通过酶切图谱、测序、Southern杂交、PCR-ELISA、点杂交或实时PCR反应进行了验证。用上述方法该特异性未发生改变，片段大小也一致，而且与阳性对照相同，不含GMO的非GMO对照不存在任何相似大小的扩增片段。

――所有对照和标准品都显示正常结果。

2个平行样品的检测结果应一致。出现不一致的，应重做2个平行样品，最终结果以多数结果为准。

10.2.2 定性PCR检测结果的表述

10.2.2.1 在模板DNA的量超过被测物种基因组（内标准基因）DNA量20000倍的情况下，按下列方式表述结果：

――对于阴性结果：“该样品未检出×××基因”；

――对于阳性结果：“该样品检出×××基因”。

10.2.2.2 在模板DNA的量低于被测物种基因组（内标准基因）DNA量20000倍的情况下，按下列方式表述结果：

――对于阴性结果：“该样品中DNA含量不足，建议对样品做定量分析以确定所用检测方法的灵敏度”；

――对于阳性结果：“该样品检出×××基因”。

11 检验报告

检验报告应包括下列内容：

――鉴定样品所需的所有信息；

――引用的标准和方法，并说明是定性还是定量方法及灵敏度；

――应用哪种定量方法（终点法或实时PCR）；

――接收样品和分析样品的大小；

――样品的接收日期；

――样品的分析日期；

――测试样品的大小；

――检测结果；

――测试中观察到的任何特殊情况；

――对结果可能产生影响的任何其他异常情况。