菌种保藏的方法

菌种是国家重要的生物资源，鉴于其自身的遗传性和变异性，在菌种保藏过程中，如何降低菌种的衰亡速度，防止杂菌污染，保持菌种遗传性状不变异，使优良高产菌株长期在生产中应用，成为食用菌领域一项重要的课题。为适应群众性生产的需要，为适应群众性生产的需要，本文介绍了几种简单易行、实用效果好的菌种保藏方法。

一、菌种保藏基本原理

通过低温、干燥、缺氧和饥饿等手段来达到最大限度降低菌丝体的生理代谢。首先要挑选优良纯菌种，包括菌丝体和它们的孢子；其次，根据其生理、生化特点，人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物的代谢作用，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长菌种生命以及使菌种保持原有的性状，防止变异。

二、 菌种保藏的方法

试管斜面菌种系列保存方法

1、低温定期移植保藏法

将需要保藏的菌种接种在适宜的斜面培养基上，适温培养，当菌丝健壮地长满斜面时取出，放在3~5℃低温干燥处或4℃冰箱中保藏，每隔3~6个月移植转管1次，具体应根据菌种特性决定。保藏时要注意环境湿度不能太高，以防霉菌通过棉塞进入管内。因此，若用棉塞，可用干净的塑料薄膜或牛皮纸包扎棉塞，也可用无菌的白胶塞，并用石蜡涂封，即可减少污染的机会，也可防止培养基干燥。除草菇外，大多食用菌菌种都能采用此法保藏。

2、液体石蜡保藏法

取化学纯液体石蜡装于三角瓶中高压灭菌后，放入40℃恒温箱中，蒸发其中水分，至石蜡油完全透明为止。将处理好的石蜡油移接在空白斜面上，28～30℃下培养2～3d，证明无杂菌生长方可使用。然后将母种接在斜面培养基上，当菌丝在斜面上生长丰满后，将液体石蜡注在斜面上，注入量以高出斜面1cm为宜，使菌种与空气隔绝，降低其新陈代谢能力。管口用灭过菌的白胶塞塞紧，并用石蜡涂封，直立放在室内干燥处或冰箱内保藏。一般可保存1年以上，在低温下保藏时间还可延长。使用时从斜面上挑取菌丝少许，移接到新鲜斜面培养基上，经培养即可。由于菌丝体沾有液体石蜡而影响其生长，需再经1次移接才能恢复正常生长。

3、白胶塞封口保存法

选择与试管口径相符的白胶塞，用0.2%煤酚皂溶液洗涤，浸泡在酒精内待用。当试管斜面长满菌丝后，在无菌条件下拔去棉塞，取浸泡的白胶塞1个，通过火焰迅速塞入试管口内，并用石蜡熔封。此法能达到与石蜡油封存相似的效果。用该法保存菌种可存活1～3年，但以每年移植1次为好。

4、蒸馏水保藏法

将8成熟试管菌种放在接种箱内，注入蒸馏水，将培养基斜面全部淹没至管口2cm。管口用白胶塞塞紧，并用石蜡涂封，常温下置于阴凉处立放，可以保藏1年左右。

非斜面固体菌种系列保存法

1、麦麸保藏法

将麦麸和水按0.80∶1充分拌匀后，装入试管高压灭菌，经无菌检查合格后接种，适温下培养至菌丝体发育好后，将试管放入真空干燥器内，用真空泵将麦麸培养基内水分抽干，然后移入盛有硅胶的干燥器内，用凡士林密封在常温下保存，可保藏3～5年。

2、麦粒保藏法

取优质小麦，淘洗后浸入20℃水中5h，捞出稍晾干，装入试管，占管深1/3，高压灭菌后趁热摇散，冷却后接入菌丝体，适温培养至菌丝长满基质后用石蜡封棉塞，置于冰箱或20℃以下干燥处，可保藏1～2年。

3、木屑保藏法

将阔叶树木屑78％、麦麸20％、蔗糖1％、石膏粉1％，混合后加水拌匀，装入试管灭菌后，接入斜面菌种，在适温下培养，待菌丝长至试管2/3时用石蜡封棉塞，置低温或常温下保藏，一般可保藏1~ 2年。

4、稻草粉保存草菇菌种

草菇斜面菌种在2～4℃下保存2d便失去生活力，室温下保存又因斜面培养基失水太快影响菌种存活。用稻草粉保存草菇菌种有其独特的优越性。其配方为稻草粉75%、麦麸22%、石膏粉1%、碳酸钙1%、蔗糖1%、适量的水拌匀调湿。装入试管高压灭菌后按常规接种培养，当菌丝长到试管2/3时，管口棉塞用石蜡熔封。常温下保存至次年，不影响其活力和种性。

液体系列菌种保存法

1、生理盐水保藏法

将待保藏的菌种接入马铃薯培养液中，在250mL三角形瓶中装60mL培养液，振荡培养或每天摇动5～10次，培养5～7d，然后将形成的菌丝球用无菌吸管吸入装有５mL无菌生理盐水试管中，每管移入4～5个菌丝球，塞上无菌白胶塞，用石蜡涂封，置低温下可保藏1～2年。

2、营养液保存法

营养液的配方为马铃薯汁20%、葡萄糖2%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%、硫酸铵微量。每支试管内装5mL，灭菌后用无菌吸管吸取生理盐水保藏法深层培养的菌丝球4～5个于试管中，10~25℃的室温下保存，可存活2～3年，其保存效果优于生理盐水保存法。不影响菌株形成子实体的能力。

3、无菌水保存法

先将培养好的斜面菌种切成小块，连同培养基移入盛有适量无菌蒸馏水的试管中，然后用白胶塞封口，在20℃左右的室温下保存。可存活1～2年。也可用磷酸缓冲液做保存液，其缓冲液的pH值视各保存菌株生长的酸碱度而定。该法操作简便易行。

利用孢子保存菌种系列方法

1、滤纸片保藏法

取白色（收集深色孢子）或黑色（收集白色孢子）滤纸，剪成4.0cm×0.8cm的小纸条，平铺在培养皿中用纸包裹进行灭菌。采用钩悬法收集孢子，让孢子落在滤纸条上。将载有孢子的滤纸条放入保藏试管中，白胶塞封口，再将保藏试管放入干燥器中1～2d，除去滤纸水分，然后低温保藏。保存期可达２～10年。

2、沙土管保藏法

取河沙用水浸泡洗涤数次，过60目筛除去粗粒，加用1％稀盐酸煮沸30min，以除去其中的有机质，再用水冲洗至pH值达到中性，烘干备用。同时取非耕作层的瘦黄土或红土，用水反复冲洗至中性，烘干碾细，过100目筛，将处理好的沙与土以2～4∶1混匀，然后分装小试管内，每管装0.5g，高压灭菌（1.5kg/cm2）3次，再干热灭菌（160℃，2h）1次，待无菌检验合格后方可使用。将已形成孢子的斜面菌种，在无菌条件下注入无菌水3mL，刮菌苔，制成菌悬液，再用无菌吸管吸取菌液滴入砂土管中，以浸透砂土为止。将接种后的沙土管放入盛有干燥剂的真空干燥器内，接上真空泵抽气至沙土干燥为止。真空干燥操作需在孢子接入后48h内完成，以免孢子发芽。制备好的沙土管石蜡封口，在低温下可保藏2～10年。

此外，还有甘油保藏法、枝条保藏法、超低温液氮保藏法、冷冻真空干燥法等。菌种保藏方法虽多，但也各有利弊。其中低温定期移植保藏法虽然简单易行，不需特殊设备，但需几个月转管1次，转管的次数多了，变异的可能性就增大，易造成菌种衰退。

近年来人们找到一种目前认为最有效广谱安全的保藏方法——超低温液氮保藏法，ATCC 用这种方法保藏双孢蘑菇，9年后菌种仍保持稳定，是目前国际上公认为较为理想的菌种保藏方法。但需要液氮保藏罐设备，且液氮来源有限，费用高，只有少数科研院所使用，无法推广。此外，还有冷冻真空干燥法，此法一般可保存10年以上，但成本较高。

三、菌种保藏效果的鉴定

常用指标是菌株的存活率和接种物成活率。为确切判断菌株在保藏后是否发生变异，还须从以下4个方面进行观察和测定：①生物学特征，如菌丝形态、颜色等；②对基质分解能力，如走菌、吃料速度等；③遗传特征，如相关酶的酶谱、酶活力等；④生产出菇能力，包括产量、质量。通过经常检验，以确保不出现任何退化迹象的菌株取得菇农的信赖。通过保藏菌种的效果鉴定，可以对保藏方法加以改善，使保藏体系更加完善。

编辑：foodnews